Deze grote voorstelling van de zondeval is geschilderd in de zestiende eeuw en toont ons het bepalende moment waarop het kwaad op aarde terecht komt. Adam staat links van de boom en Eva rechts. Zij geeft een appel aan Adam en plukt er nog een voor haarzelf. De slang kronkelt ondertussen om de stam van de boom en lispelt in Eva’s oor. Op de voor- en achtergrond wordt ons een blik in de Hof van Eden, het paradijs, gegund waarin diverse dieren door een parkachtig landschap lopen. Het fraaie vogeltje en de hagedis op de voorgrond zorgen voor een sterke dieptewerking in het schilderij.

Volgens het Bijbelverhaal in Genesis leefden Adam en Eva in de Hof van Eden. Ergens na de schepping werd de eerste vrouw door een slang verleid om een vrucht van de boom van Goed en Kwaad. God had Adam verboden de vruchten van deze boom te eten en had hen gewaarschuwd dat wanneer zij dit toch zouden doen, zij zouden sterven. De slang echter, beweerde juist dat zij niet zouden sterven maar dat hun ogen open zouden gaan, zij als God zouden zijn en kennis zouden hebben van goed en kwaad. De vruchten in de boom zijn zeer aantrekkelijk, volrijp en kleurig. Ze zijn ook begerenswaardig door de vermeende wijsheid die de slang beloofde. Eva nam een hap en gaf ook een vrucht aan Adam die er ook een hap van nam. In de kunsten is voor de vrucht vaak een appel afgebeeld. Dit komt vermoedelijk omdat het Latijnse woord ‘malus’ zowel appelboom als slecht kan betekenen.

Dit staat bekend als de Zondeval. Adam en Eva laten zien dat ze het de verleiding van het kwaad niet kunnen weerstaan en verkiezen boven hun vertrouwen in en trouw aan God, hoewel hij hen een leven in het paradijs had gegeven. Zij zijn hem niet dankbaar en gehoorzaam maar ze zijn opstandig en willen als God zelf zijn. Zij willen zelf uitmaken wat goed en kwaad is.

De gevolgen zijn groot; de relatie met God wordt beschadigd. Plots zien zij elkaars naaktheid en schamen zich ervoor. Ze bedekken zich met bladeren en verschuilen zich voor God. Het kwaad zit nu in het hart van de mens evenals de sterfelijkheid. De mens is gevallen in het ongeluk. Ondanks de ongehoorzaamheid van de mens roept God Adam en Eva bij zich. Dat is de genade van God. Hij vraagt ze of ze gegeten hebben van de boom. Direct openbaart het kwaad in de mens zich; Adam geeft Eva de schuld en Eva geeft de slang de schuld.

De zestiende-eeuwse beschouwer van dit schilderij was zich zeer bewust van het bovenstaande en het gegeven dat men hierdoor sterfelijk was geworden. In de perceptie van de zestiende-eeuwer is de mens sinds de zondeval geneigd de schuld af te schuiven op een ander in plaats van eerlijk voor diens fout of zonde uit te komen. Door de zondeval ontstond in de Christelijke leer de erfzonde, de zondigheid die ieder mens aankleeft bij geboorte als nazaat van Adam en Eva. Het thema was in de zestiende en zeventiende eeuw zeer populair in de kunsten en is vaak verbeeld. Met name in de prentkunst van de zestiende eeuw is het een veel voorkomend thema.

Afgebeeld is het moment waarop Eva de appel aan Adam geeft. Zij heeft al gegeten van de vrucht en bedekt haar naaktheid. Adam is afgebeeld als gespierde, sterke en gezonde man. Dit is onderdeel van het beeld van die tijd. Het weke en zwakke vrouwenlichaam moest het contrast zijn met de sterkte van de man. Wat dat ook nog versterkt is de kleur van de huid van Eva, melkwit.

De traditionele compositie van Adam en Eva aan weerszijden van de boom van de kennis van goed en kwaad vindt zijn oorsprong in een prent van Albrecht Dürer uit 1504. De boom uit het midden van de Hof van Eden is centraal geplaatst en Adam en Eva staan aan weerszijden.
Adam staat net als in Dürers prent met zijn blik opzij gericht en zijn rechterarm is om een tak geslagen. Zijn linkerhand rijkt naar Eva. Opmerkelijk in dit schilderij is dat de schilder in eerste instantie had bedacht om Adam aan de andere kant van de boom te plaatsen en Eva links. Achter het hoofd van Eva is namelijk het hoofd van Adam geschilderd. Ook de slang wees met zijn kop eerst de andere kant op en kronkelde anders rond de stam. Hoewel deze eerste compositie in de kunst wel voorkomt, Lucas van Leyden heeft een prent vervaardigd waarop Adam voor de beschouwer rechts staat, is zij veel zeldzamer dan andersom. Waarom de schilder zich bedacht is vooralsnog onbekend, het is echter voorstelbaar dat de opdrachtgever zich niet kon vinden in de in zijn ogen afwijkende compositie.

De figuur van Eva vertoont grote overeenkomsten met een prent van Crispijn de Passe naar Maarten de Vos die in 1574 voor het eerst in druk verscheen. Zij geeft op dezelfde wijze een appel aan Adam terwijl ze een tweede plukt. Haar lichaam is echter net anders gedraaid.
De hagedis op de voorgrond is een motief dat alleen bekend is van een prent van Hans Sebald Beham. Het vogeltje is zeer origineel.
Dendrochronologische onderzoek heeft aangetoond dat het paneel beschilderbaar moet zijn geweest vanaf 1549. Echter, gezien de houding van Adam en Eva, is een datering omstreeks 1575 logischer. De vooralsnog anonieme schilder heeft op een zeer eigen wijze, maar passend in de bestaande beeldtradities deze grote voorstelling van de Zondeval vervaardigd.